تست ELISA یا enzme-linked immunosorbent assay یک روش بیوشیمی تحلیلی برای کمی سازی موادی مثل آنتی بادی ها ، آنتی ژن ها ، پروتئین ها ، گلیکوپروتئین ها و هورمون ها است که در آزمایشگاه ها انجام می شود. در این تست سنجش با استفاده از یک آنزیم (EIA) برای تشخیص وجود لیگاند که معمولا یک نوع پروتئین است در نمونه مایع با استفاده از آنتی بادی های هدایت شده به پروتئین ها انجام می گیرد.

تست الایزا یک تست ارزان با دقت نسبتا خوب است که در آن با استفاده از یک نمونه ی خونی و یک ماده ی معرف برای تغییر رنگ محلول ، میزان آنتی ژن از طریق اتصال آن با آنتی بادی مشخص می شود.

این تکنیک در زمینه های پزشکی ، بیوتکنولوژی ، آسیب شناسی گیاهی ، کنترل کیفیت در صنایع و … استفاده می شود.

تاریخچه ی پیدایش و توسعه ی تست الایزا

قبل از توسعه ی تکنیک الایزا تنها راه انجام سنجش ایمنی بدن روشی به نام ” رادیوایمونواسی ” بود که در آن از آنتی بادی های برچسب دار یا رادیواکتیو استفاده می کردند اما از آنجا که رادیواکتیویته یک تهدید بهداشتی بالقوه به شمار می رفت دانشمندان به دنبال یک جایگزین امن تر می گشتند که در آن به جای استفاده از امواج رادیواکتیو ، از تغییر رنگ به عنوان سیگنال استفاده شود.

سرانجام در سال 1971 پس از امتحان کردن راه های مختلف دو دانشمند در دانشگاه استکهلم سوئد به نام های Peter Perlman و Eva Engvall مقاله ای منتشر و در آن تکنیک الایزا را شرح دادند و بعد این روش به تدریج توسعه یافت و پیشرفته تر شد.

قاعده ی کلی تست الایزا

به طور کلی الایزا با جفت شدن آنتی بادی و آنتی ژن کار می کند و انجام آن به حداقل یک آنتی بادی اختصاصی برای یک آنتی ژن خاص نیاز دارد . در این تست نمونه ای که حاوی مقدار نامعلومی از آنتی ژن است در صفحه ای مخصوص ( پلیت الایزا ) قرار می گیرد و بعد از بی حرکت شدن آنتی ژن ، به آن آنتی بادی اضافه می شود و آنتی ژن و آنتی بادی با هم تشکیل یک کمپلکس می دهند سپس صفحه ی مخصوص چند بار شسته می شود تا آنتی بادی هایی که به صورت غیراختصاصی متصل شده حذف و فقط آنتی بادی های اختصاصی باقی بمانند و پس از شست و شوی نهایی با افزودن آنزیم سیگنالی ساخته می شود که مقدار آنتی ژن نمونه ی مورد آزمایش را نشان می دهد.

مراحل انجام تست الایزا

تست الایزا به کمک کیت های آزمایشگاهی آماده انجام می شود که شامل یک صفحه یا پلیت مخصوص است که معمولا 96 چاهک دارند که شامل مقدار نامشخصی از آنتی ژن است.

به طور کلی انجام این تست شامل 4 مرحله است :

1. مرحله ی کوتینگ (Coating)
2. مرحله ی بلاکینگ (Bloaking)
3. مرحله ی تشخیص با استفاده از معرف
4. مرحله ی آنالیز داده های به دست آمده

مرحله ی کوتینگ مرحله ای است که طی آن کارخانه ی سازنده ی کیت آنتی ژن ها را کف چاهک های پلیت قرار می دهد و در مرحله ی بعد فضای خالی بین آنتی ژن های قرار گرفته در چاهک توسط یک پروتئین خنثی مثل آلبومین سرم گاوی پر می شود.

بعد از دادن زمانی مشخص برای انجام واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی باید برای مرحله ی تشخیص یک معرف نشان دار شده با آنزیم که به آن “کانژوگه” می گویند اضافه شود تا واکنش نشان دار و قابل تشخیص شود.

در آخر برای تغییر رنگ به چاهک ها سوبسترا اضافه می شود و سبب تشکیل رنگ در چاهک می شود و برای متوقف کردن واکنش محلول استاپ (Stop) افزوده می شود و داده های به دست آمده در تست توسط دستگاه مخصوص در طول موج های مشخص اندازه گیری و بررسی می شود.

نکته ی مهم در تست الایزا مرحله ی شست و شوی چاهک ها است . در این تست باید بین هر یک از 4 مرحله ی بالا یک تا چند بار شست و شو با استفاده از بافر و یک شوینده ی غیر یونی برای حذف مواد اضافه انجام شود.

انواع تست الایزا

تست الایزا انواع مختلفی دارد که در بعضی مراحل با یکدیگر متفاوت هستند از جمله ی آن ها می توان به موارد زیر اشاره کرد :

1. الایزای مستقیم
2. الایزای غیرمستقیم
3. الایزای ساندویچی
4. الایزای رقابتی
5. الایزای معکوس

الایزای مستقیم ساده ترین نوع این تست است که در آن آنتی ژن به طور منفعل در کف چاهک وجود دارد و به آن آنتی بادی ، بافر ، محلول پروتئینی و آنزیم ها برای تغییر رنگ اضافه می شود و در آخر نتایج با استفاده از دستگاه طیف سنج بررسی می شود.

از این نوع الایزا برای تشخیص آنتی ژن به صورت کیفی یا کمی در نمونه و یا برای غربالگری و نقشه برداری استفاده می شود با این حال به دلیل حساسیت نسبتا پایین این نوع نسبت به بقیه ی روش ها معمولا خیلی مورد استفاده قرار نمی گیرد.

الایزای غیر مستقیم تقریبا در همه ی مراحل به جز یک مرحله ی شست و شویی اضافی و اضافه کردن چند مرحله ای آنتی بادی با روش الایزای مستقیم یکسان است. این روش نسبت به الایزای مستقیم حساس تر و دقیق تر است و انعطاف پذیری بالاتری دارد همچنین در این روش به آنتی بادی برچسب دار کمتری نیاز است پس صرفه ی اقتصادی بالاتری هم دارد .

شاید بتوان گفت تنها نقطه ضعف عمده ی این نوع الایزا خطر واکنش متقابل بین آنتی بادی های تشخیص ثانویه است.

در الایزای ساندویچی آنتی ژن ها بین دو لایه آنتی بادی قرار می گیرند( مثل ساندویچ ) و در این روش هر دو تکنیک الایزای مستقیم و غیر مستقیم می تواند پیاده سازی شود.

این روش نسبت به الایزای مستقیم و غیرمستقیم از دقت و حساسیت بالاتری برخوردار است با این حال انجام آن سخت و وقت گیر است و به علت گران بودن صرفه ی اقتصادی چندانی ندارد.

عوامل مداخله در تست الایزا

عوامل مداخله در تکنیک الایزا به عواملی گفته می شود که با آزمایش تداخل داشته باشند و باعث بروز خطا و داده های اشتباه شوند.

از جمله ی این موارد می توان به شکل و کیفیت پایین پلیت و چاهک ها ، آلودگی یا کیفیت پایین بافر ، دما یا غلظت نامناسب مواد ، نحوه ی شست و شوی چاهک ها و نحوه ی خواندن و آنالیز داده ها و خطای انسانی هنگام خواندن نتایج اشاره کرد.

اهمیت بالینی تست الایزا

تست الایزا در عرصه درمانی اهمیت بسیار بالایی دارد . از کاربردهای الایزا در این عرصه می توان به موارد زیر اشاره کرد :

• شناسایی و اندازه گیری میزان آنتی بادی خون که می تواند برای تشخیص هپاتیت ، HIV و … استفاده شود.
• شناسایی و تخمین سطح نشانگرهای تومور
• تشخیص سطح هرمون ها مثل تستوسترون ، پرولاکتین و …
• ردیابی شیوع بیماری هایی مثل وبا و آنفولانزا
• تشخیص مواجهه ی گذشته ی فرد با بیماری های مثل لایم و هپاتیت
• غربالگری خون های اهدا شده به دنبال عفونت های ویروسی احتمالی
• تشخیص مواد مخدر موجود در نمونه

تست الایزا بخش مهمی از مراقبت های پزشکی و تحقیقات علمی است. همکاری بین دانشمندان ، تکنسین های آزمایشگاهی ، پزشکان ، پرستاران و دیگر متخصصان پزشکی برای جمع آوری نمونه مناسب ، آزمایش ، تفسیر ، تشخیص ، آموزش موثر بیمار و برنامه ریزی درمان ضروری است.

فناوری های الایزا همچنان به رشد خود ادامه می دهند و نقش عمده ای در تحقیقات بالینی دارند که اجازه توسعه آزمایش های تشخیصی تر و غربالگری را می دهند. ادامه تکامل آزمایش الایزا برای آینده پزشکی امیدوار کننده است و اجازه ی بهبود فرایند تشخیص زودهنگام بیماری هایی مثل HIV و تشخیص بارداری را داده است.