RNA به عنوان ماده اولیه

PCR رونویسی معکوس کمی (RT-qPCR) زمانی استفاده می شود که ماده اولیه RNA باشد. در این روش ابتدا RNA توسط رونویسی معکوس از RNA کل یا RNA پیام رسان (mRNA) به DNA مکمل (cDNA) رونویسی می شود. سپس از cDNA به عنوان الگوی واکنش qPCR استفاده می شود. RT-qPCR در کاربردهای مختلفی از جمله تجزیه و تحلیل بیان ژن، اعتبار سنجی RNAi، اعتبارسنجی ریزآرایه، تشخیص پاتوژن، آزمایش ژنتیکی و تحقیقات بیماری استفاده می شود.

RT-qPCR یک مرحله ای در مقابل دو مرحله ای

RT-qPCR را می توان در یک سنجش یک مرحله ای یا دو مرحله ای انجام داد. سنجش‌های یک مرحله‌ای، رونویسی معکوس و PCR را در یک لوله و بافر، با استفاده از یک رونوشت معکوس همراه با یک DNA پلیمراز، ترکیب می‌کنند. RT-qPCR یک مرحله ای فقط از پرایمرهای توالی خاص استفاده می کند. در سنجش دو مرحله‌ای، مراحل رونویسی معکوس و PCR در لوله‌های جداگانه، با بافرهای بهینه‌شده مختلف، شرایط واکنش و استراتژی‌های پرایمینگ انجام می‌شوند.

مزایا :

• تغییرات تجربی کمتر از آنجایی که هر دو واکنش در یک لوله انجام می شود
• مراحل کمتر پیپتینگ خطر آلودگی را کاهش می دهد
• مناسب برای تقویت / غربالگری با توان بالا 
• سریع و با قابلیت تکرار بالا

•  یک مخزن cDNA پایدار تولید می شود که می تواند برای مدت زمان طولانی ذخیره شود و برای واکنش های متعدد استفاده شود.
• ژن های هدف و مرجع را می توان از یک مخزن cDNA بدون مالتی پلکس شدن تکثیر کرد
• بافرهای واکنش بهینه و شرایط واکنش را می توان برای هر واکنش جداگانه استفاده کرد
• گزینه های پرایمینگ انعطاف پذیر

معایب :

• بهینه سازی دو واکنش جداگانه غیرممکن است
• حساسیت کمتر از دو مرحله ای است زیرا شرایط واکنش یک سازش بین دو واکنش ترکیبی است
• شناسایی اهداف کمتر در هر نمونه

• استفاده از چندین لوله و مراحل پیپت، واکنش را در معرض خطر بیشتری از آلودگی DNA قرار می دهد.
• به بهینه سازی بیشتر از یک مرحله ای نیاز دارد