توالی یابی DNA ، فرآیند تعیین توالی نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA است. DNA هر موجود زنده از یک توالی منحصر به فرد از نوکلئوتیدها تشکیل شده است. تعیین توالی می تواند به دانشمندان در مقایسه DNA بین موجودات کمک کند، که می تواند در نشان دادن چگونگی ارتباط موجودات موثر باشد.

اندازه کروموزوم های انسان از حدود 50,000,000 تا 300,000,000 جفت باز متغیر است و هر انسان دارای 46 کروموزوم است. این بدان معناست که ما در کل تقریباً 3.2 میلیارد باز DNA داریم!

در حال حاضر، ما نمی توانیم یک ژنوم یا حتی یک کروموزوم را از ابتدا تا انتها توالی یابی کنیم. ما باید آن را به قطعات کوچکتر و قابل کنترل تر تقسیم کنیم تا بتوانیم به بررسی هر قطعه بپردازیم و آن را توالی یابی کنیم.

روش های متفاوتی برای توالی یابی DNA وجود دارد که در ادامه به توضیح چند نمونه از آن ها میپردازیم.

Sanger Sequencing

توالی ‌یابی سنگر ، یکی از روش‌های توالی ‌یابی DNA  بر پایه خاتمه رشته دی اکسی نوكلئوتايد توسط DNA پلیمراز در فرایند همانندسازی است که شرکت Applied Biosystems برای اولین بار آن را تجاری کرد. فردریک سنگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ این روش را ابداع کردند و یکی از  پرکاربردترین روش ها در طی ۳۹ سال اخیر بوده است.

دراین فرایند ابتدا باید دو رشته DNA را از یکدیگر جدا کنیم. سپس یک پرایمر که مربوط به یک انتهای توالی است ؛ متصل می شود و سنتز یک پلی نوکلئوتید تک رشته ای را در حضور آنزیم DNA پلیمراز با استفاده از DNA دناتوره به عنوان رشته الگو آغاز می کند. در ادامه چهار نوع محلول پلیمراز وارد میشوند که شامل چهار نوع دی اکسی نوکلئوتید استاندارد (dATP، dGTP، dCTP، و dTTP) هستند این مولکول ها بر اساس نوع باز موجود در رشته الگو در کنار یکدیگر قرار گرفته و رشته مورد نظر را میسازند تا زمانیکه یک نوکلئوتید خاتمه  ddNTP به رشته در حال ساخت متصل شود و فرایند را خاتمه دهد.

ddNTP ها ( ddATP، ddGTP، ddCTP یا ddTTP)، اتم اکسیژن ۲ یا ۳ ندارند و به همین علت واکنش پلیمریزاسیون DNA را زودتر از موعد خاتمه می دهند.

در اولین تلاش ها برای استفاده از روش سنگر، مولکول DNA ابتدا با استفاده از یک پرایمر برچسب دار تکثیر شد و سپس به چهار لوله آزمایش تقسیم شد که هر کدام تنها یک نوع ddNTP داشتند. یعنی هر مخلوط واکنش تنها یک نوع نوکلئوتید اصلاح شده خواهد داشت که می تواند باعث پایان زنجیره شود. پس از تکمیل این چهار واکنش، مخلوط مولکول های DNA که با پایان زنجیره ایجاد می شوند، روی ژل پلی آکریل آمید تحت الکتروفورز قرار می گیرند و با توجه به طول جدا می شوند.

6 مرحله توالی یابی سنگر در یک نگاه :

1. DNA   دو رشته ای (dsDNA) به دو DNA تک رشته ای (ssDNA) تجزیه می شود.
2. یک پرایمر که مربوط به یک انتهای توالی است متصل می شود.
3. چهار محلول پلیمراز با چهار نوع dNTP اما تنها یک نوع ddNTP اضافه می شوند.
4. واکنش سنتز DNA آغاز می شود و زنجیره تا زمانی که یک نوکلئوتید خاتمه به طور تصادفی ترکیب شود، ادامه می یابد.
5. قطعات DNA حاصل به ssDNA دناتوره می شوند.
6. قطعات دناتوره شده توسط الکتروفورز ژل جدا شده و توالی تعیین می شود.

Maxam-Gilbert sequencing

در سال های 1976-1977، آلن ماکسام و والتر گیلبرت یک روش توالی یابی DNA را بر اساس اصلاح شیمیایی DNA و برش متعاقب آن در جایگاه های خاص توسعه دادند. این روش نیاز به برچسب زدن رادیواکتیو در یک انتها و خالص سازی قطعه DNA برای تعیین توالی دارد.

در مرحله اول برای آماده سازی نمونه ، مولکول DNA را به صورت تک رشته دناتوره می‌کنند و پس از آن در انتهای ’۵ آن برچسب گذاری انجام می‌دهند که در این روش اغلب از فسفر ۳۲ استفاده می ‌شود.

در مرحله دوم DNA  شکسته میشود ( توسط پیپریدین (Piperidine) و دو ترکیب شیمیایی دیگر که به پورین‌ ها و پیریمیدین‌ های مولکول DNA حمله می‌کنند) . عملیات شیمیایی باعث ایجاد شکست در نسبت های کوچک یک یا دو نوکلئوتید از چهار نوکلئوتید بر اساس هر یک از چهار واکنش G ، A+G ، C ،C+T  می شود.بنابراین یک سری قطعات نشاندار شده از انتهای نشاندار شده رادیویی تا اولین محل “برش” در هر مولکول تولید می شود.

 با قرار دادن ۴ لوله آزمایش برای هر ترکیب شیمیایی ، می‌توان ۴ نمونه از قطعات با برش‌های یکسان را به دست آورد.  بعد از دستیابی به قطعات برش خورده DNA نمونه،  هر کدام از آن  ها بر روی ژل پلی آکریل آمید با درصد بالا مورد الکتروفورز قرار می‌ گیرند.

برای تجسم قطعات ، ژل در معرض فیلم اشعه ایکس برای اتورادیوگرافی قرار می گیرد و یک سری نوارهای تیره را ایجاد می کند که هر کدام مربوط به یک قطعه DNA نشاندار شده رادیویی هستند که می توان از آن ها توالی را استنباط کرد.

High Throughput Sequencing

توالی یابی دقیق (توالی یابی با توان عملیاتی بالا) ، برای تعیین توالی های بازه های نسبتا طولانی DNA، به خصوص در حجم های پایین، مفید است. با این حال، زمانی که تعداد زیادی از مولکول ها باید به سرعت توالی یابی شوند، می تواند گران و دشوار باشد.

در این روش ، سه تغییر عمده در مقایسه با روش سنگر وجود دارد. اولین مورد، توسعه یک سیستم بدون سلول برای شبیه سازی قطعات DNA بود. به طور سنتی، قطعه ای از  DNA که باید توالی یابی می شد، ابتدا به یک پلاسمید پروکاریوتی شبیه سازی شده و قبل از استخراج و خالص سازی، درون باکتری تکثیر می شد. توالی یابی با توان عملیاتی بالا یا تکنولوژی های توالی یابی نسل جدید دیگر به این روش کار فشرده و زمان بر متکی نیستند.

دوم، این روش ها ، فضایی برای اجرای میلیون ها واکنش توالی یابی به صورت موازی ایجاد کرده اند. این یک گام بزرگ رو به جلو از روش های اولیه بود که در آن به هشت مخلوط واکنش مختلف برای تولید یک توالی نوکلئوتیدی قابل اعتماد نیاز بود. در حالی که HTS هزینه و زمان را کاهش می دهد .

ظهور HTS کاربردهای ژنومیک را بسیار گسترش داده است. توالی یابی DNA اکنون به بخشی جدایی ناپذیر از علوم پایه، تحقیقات ترجمه ای، تشخیص های پزشکی و پزشکی قانونی تبدیل شده است.

منابع

https://biologydictionary.net/dna-sequencing/

https://microbenotes.com/dna-sequencing-maxam-gilbert-and-sanger-dideoxy-method/

https://www.cd-genomics.com/blog/sanger-sequencing-introduction-principle-and-protocol/

https://www.yourgenome.org/stories/what-is-dna-sequencing