مهندسان زیست پزشکی و ژنتیک در دانشگاه دوک و کالج پزشکی آلبرت انیشتین پروتئین فلورسنت کوچکی را طراحی کرده اند که نوری را که به اعماق بافت بیولوژیکی نفوذ می کند ساطع و جذب می کند. این پروتئین متناسب با طول موج‌های طیف مادون قرمز نزدیک (NIR)، می‌تواند به محققان کمک کند تا تصاویر زیست‌پزشکی عمیق‌تر، تمیزتر و دقیق‌تری را ثبت کنند.

دکتر جونجی یائو، استادیار مهندسی زیست پزشکی در دوک، گفت: «مولکول‌های بیولوژیکی به طور طبیعی نور را در طیف مرئی که حدود 350 تا 700 نانومتر است، جذب و منتشر می‌کنند. بنابراین هنگام استفاده از آن برای تصویربرداری از بافت عمیق، مانند تلاش برای رصد ستارگان در نور روز است. سیگنال‌ها از بین می‌روند.» یائو و همکارانش در مقاله‌ای با عنوان «تصویربرداری SWIR بافت عمیق با استفاده از پروتئین فلورسنت نزدیک به فروسرخ نزدیک به قرمز با طراحی منطقی، توسعه پروتئین فلورسنت جدید خود را در Nature Methods گزارش کردند.»

تصویربرداری از بافت های عمیق با نور چالش برانگیز است. نور مرئی اغلب به سرعت توسط ساختارها و مولکول‌های بدن جذب و پراکنده می‌شود و از دیدن عمق بیشتر از یک میلی‌متر در بافت جلوگیری می‌کند. اگر آنها موفق به کاوش بیشتر شوند، موادی مانند کلاژن یا ملانین اغلب تصویر را گل آلود می کنند و از طریق فلورسانس طبیعی خود صدایی معادل نویز پس زمینه ایجاد می کنند. همانطور که نویسندگان توضیح دادند، «بافت‌های بیولوژیکی به دلیل جذب هموگلوبین و ملانین، و همچنین پراکندگی بافت، که اساساً عمق تصویربرداری با وضوح بالا را محدود می‌کند، تضعیف نوری قوی در محدوده طول موج مرئی (350-700 نانومتر) دارند. “

برای رهایی از این دشواری ها، یائو و ولادیسلاو ورخوشا، دکترای ژنتیک، پروفسور ژنتیک در کالج پزشکی آلبرت انیشتین، پروتئینی ساختند که طول موج های طولانی تر نور را در طیف مادون قرمز نزدیک (NIR) جذب و منتشر می کند. یائو گفت: “بافت شفاف ترین در پنجره 700-1300 نانومتری نور NIR است.” در آن طول موج‌ها، نور می‌تواند عمیق‌تر به بافت نفوذ کند، و چون فلورسانس پس‌زمینه طبیعی کمتری برای فیلتر کردن وجود دارد، می‌توانیم نوردهی طولانی‌تری داشته باشیم و تصاویر واضح‌تری بگیریم.

ورخوشا و آزمایشگاهش از فرآیندی به نام تکامل مولکولی هدایت‌شده برای مهندسی پروتئین‌های خود استفاده کردند و با استفاده از گیرنده‌های نوری که معمولاً در باکتری‌ها یافت می‌شوند به‌عنوان پایه‌ای برای ساختار استفاده می‌کنند. تیم تحقیقاتی خاطرنشان کرد: «فروپتورهای NIR پیشرفته از گیرنده‌های نوری فیتوکروم باکتریایی (BphPs) مهندسی شده‌اند. ما با استفاده از طراحی منطقی، پروتئین فلورسنت miRFP718nano مبتنی بر سیانوباکتریوکروم نزدیک به فروسرخ (NIR-I) 17 کیلو دالتون را توسعه دادیم.

این گیرنده های نوری برای تحقیقات تصویربرداری مفید هستند زیرا می توانند بین حالت خاموش و فعال در هنگام برخورد با طول موج خاصی از نور جابجا شوند. آنها می توانند با بیلیوردین، یک مولکول زیستی که به مقدار زیاد در بافت پستانداران و انسان ظاهر می شود، متصل شوند. ورخوشا توضیح داد: “ما ساختار بیلی‌وردین را مطالعه کردیم تا تعیین کنیم گیرنده نوری چگونه به بهترین شکل به مولکول زیستی متصل می‌شود. پس از اینکه فرآیند اتصال را فهمیدیم، به دقت جایگزین‌های بخش‌های کلیدی مولکول متصل به بیلی‌وردین را معرفی کردیم تا اتصال الکترون را افزایش دهیم، که برای به دست آوردن فلورسانس جابه‌جایی قرمز ضروری است. در آخر، ما جهش زایی تصادفی را انجام دادیم و به دنبال آن غربالگری های با توان بالا انجام شد تا پروتئین ها تکامل یافته و روشنایی خود را افزایش دهند.”

درخشان‌ترین پروتئینی که آنها توسعه دادند، tmiRFP718nano، به راحتی در سلول‌ها و بافت‌ها تولید می‌شود و نور را درست خارج از محدوده مرئی ساطع می‌کند. اما در حالی که خود فعال سازی NIR مفید است، آنچه پس از انفجار اولیه فعالیت اتفاق می افتد، نوید بیشتری برای تصویربرداری زیست پزشکی دارد.

یائو توضیح داد: “ما دیدیم که محدوده NIR را می توان به دو منطقه اصلی تقسیم کرد. هنگامی که نور NIR برای اولین بار به این پروتئین ها برخورد کرد، آنها نور را در منطقه اول منتشر می کنند که حدود 700 تا 900 نانومتر است. اما با فروپاشی آنها، طول موج به تدریج طولانی تر می شود، مانند دم پشت یک دنباله دار. این زمانی است که آنها شروع به انتشار نور در ناحیه دوم NIR می کنند که از 900 تا 1300 نانومتر است.”

در این منطقه دوم، تمام مزایای استفاده از طول موج کوتاه‌تر، نور NIR در ناحیه یک افزایش می‌یابد: نور می‌تواند دو برابر عمیق‌تر به بافت نفوذ کند، فلورسانس پس‌زمینه به‌طور قابل‌توجهی کم‌نور است، و اجازه می دهد وضوح تصویر ساختار های پیچیده دو تا سه برابر واضح‌تر باشد.

یائو و تیمش در دوک برای اثبات این مفهوم، از تکنیک تصویربرداری به نام مادون قرمز با طول موج کوتاه (SWIR) برای آزمایش کارایی پروتئین جدید استفاده کردند. این فرآیند نور ناحیه یک NIR را به عمق بافت می فرستد تا پروتئین های فلورسنت را فعال کند. همانطور که پروتئین‌ها تجزیه می‌شوند، نور ناحیه دو NIR منتشر می‌کنند که اطلاعاتی در مورد ساختار و ترکیب بافت‌ها و سلول‌های هدف ارائه می‌کند که می‌تواند به تصاویر با وضوح بالا ترجمه شود.

برخلاف پنجره NIR-I، بافت‌های بیولوژیکی دارای اتوفلورسانس نسبتاً ضعیف و پراکندگی نوری در پنجره SWIR هستند و بنابراین افزایش زمان نوردهی می‌تواند کنتراست تصویر را بدون سیگنال‌های پس‌زمینه قوی یا محو کردن اهداف بهبود بخشد. پنجره های I و SWIR بدون تامین کروموفور بیلیوردین اگزوژن، پایداری پروتئین بالایی دارد و در تگ های پروتئینی ترمینال و داخلی عملکرد خوبی دارد.

پس از معرفی پروتئین های مهندسی شده miRFP718nano در مدل های حیوانی خود، تیم از آنها برای گرفتن تصاویری از میکروب ها در دستگاه گوارش موش، تجسم سلول های غده پستانی موش و حتی ردیابی تغییرات التهاب در کبد موش استفاده کرد. همه تصاویر گرفته شده واضح تر و دقیق تر از تصاویری بودند که با استفاده از پروتئین تصویربرداری منطقه یک NIR استاندارد ساخته شده بودند. محققان اظهار داشتند: “مقایسه miRFP718nano در محدوده NIR-I و SWIR عملکرد برتر آن را در پنجره SWIR نشان داد، مانند عمق نفوذ بیشتر، وضوح و کنتراست فضایی بالاتر، و حساسیت تشخیص بهبود یافته.” ما برتری تصویربرداری SWIR با قابلیت نانو miRFP718 را نسبت به تصویربرداری NIR-I از میکروب‌ها در دستگاه گوارش موش، سلول‌های پستانداران تزریق شده به غده پستانی موش و فعالیت NF-kB در مدل التهاب کبد موش نشان می‌دهیم… به طور کلی، ما نشان دادیم که دم بلند نشر فلورسانس خارج از پیک NIR FP با جابجایی قرمز، تصویربرداری پیشرفته بافت عمیق SWIR را امکان پذیر می کند.”

یائو و ورخوشا خوشبین هستند که ادامه همکاری آنها برای کار آنها در زمینه تصویربرداری زیست پزشکی و مهندسی پروتئین یک موهبت باشد. همانطور که Verkhusha به اصلاح و بهبود پروتئین‌های فلورسنت و حسگرهای زیستی ادامه می‌دهد، یائو هیجان‌زده است تا از ابزار جدید برای تجسم دقیق‌تر مغز و ردیابی بالقوه حرکت سلول‌های سرطانی استفاده کند. یائو گفت: “این یک جبهه جدید و هیجان انگیز از همکاری ده ساله ما است زیرا ما می توانیم از ابزارهای تصویربرداری برای هدایت تصمیمات مهندسی پروتئین استفاده کنیم، و می توانیم از مهندسی پروتئین پیشرفته برای بهبود قابلیت های تصویربرداری استفاده کنیم.”

محققان در مقاله خود به این نتیجه رسیدند: «در مقایسه با رنگ‌های فلورسنت NIR، miRFP718nano می‌تواند به طور خاص در بافت‌ها از طریق رمزگذاری ژنتیکی بیان شود، نیازی به تحویل پیچیده بیرونی ندارد و زیست سازگاری بالایی برای مطالعات طولی دارد.»

Small Fluorescent Protein Helps to Create More Detailed Biomedical Images